褐藻多糖研究の課題
西 出 英 一
日本大学生物資源科学部


 おことわり:ここに引用されている図表はページの容量上、省かせていただいています。

1.はじめに
 褐藻多糖研究の時代考証をしてみると,1883年(明治16年)スコットランドのE. C. C. Stanfordがアルギン酸を,次に,1885年(明治18年)ドイツのJ. E. O. Schmiedebergがラミナランを,更に,1913年(大正2年)スエーデンのH. Kylinがフコイダンを発見している。欧米においては前述の三つの物質は発見された翌年から研究報告が認められている。日本においては,1926年(大正15年)東京大学の厚木勝基・友田宣孝がアルギン酸の研究を,(E. C. C. Stanfordがアルギン酸を発見してから46年後である。)次に,1937年(昭和12年)東京文理科大学の三輪知雄がフコイダンの研究を,(H. Kylinがフコイダンを発見してから24年後である。)更に,1939年(昭和14年)東京文理科大学の西澤一俊がラミナランの研究を(J. E. O. Schmiedebergがラミナランを発見してから54年後である。)始めたのが最初である。その後は日本文献検索資料に見られる通りであるが,最近気になることがあります。褐藻多糖の研究者が非常に少ないことであります。例えば,国際海藻シンポジウム(International Seaweed Symposium)は名前の通り,世界の海藻関係の研究者の研究発表の場として3年に一回世界各地で開催されています。このシンポジウムへの日本の多糖研究者の出席が少ないことであります。私は,このシンポジウムに第9回から出席し,研究発表をおこない,その研究発表がEditorの目にとまり,毎回Proceedingに印刷されている者としては残念です。後輩の出席の少ないのは海藻多糖研究に魅力がない事だと思います。この事は私達の責任でもあります。
 私は1960年(昭和35年)頃から褐藻多糖の研究に携わり今日に至っています。今回,シンポジウム企画責任者の高知大学の大野正夫教授より講演依頼がありましたので,私の研究の経過を顧みて,私の考えている『褐藻多糖研究の課題』を述べてみたい。

2.フコイダン
 フコイダンの研究は共存する水溶性アルギンやラミナラン等の分別,純化の研究と言っても過言ではない。褐藻中のフコイダンは藻体内で,図1(Kloareg ・et al.1986)のようになっていると言われている。褐藻を30℃の蒸留水中に浸出すると粘質物が溶出してくる。これはフコイダンと水溶性アルギンの複合体で,卵白様粘性を有し,極めて取り扱いにくい液体であるが,この粘性はpHを酸性にするか,加熱すると喪失する。褐藻から粗フコイダンを抽出するには一般に熱水或いは希塩酸抽出の後,CPC(Cetylpyridinium chloride),CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)等の第4級アンモニウム塩を加えて分画(阿武1972)を行い溶存しているラミナランや水溶性アルギンを除去する。得られたCP−硫酸多糖複合体を中性塩で複分解して硫酸多糖を得る方法である。
 富士川・中島(1975)は,CPCによる硫酸多糖調製法を用いて,21種の褐藻中のフコイダン分布を調べ,その実験経過を詳述している。CP−硫酸多糖複合体より塩化カリウムを用いて硫酸多糖を回収する操作は21種類の褐藻全てに適用できるものではなく,適用出来ない褐藻は他の分画方法を検討する必要のあることを示唆している。このことは,CP−硫酸多糖複合体の塩化カリウムを用いて硫酸多糖が回収できる褐藻のみが研究材料として用いられることを意味する。
 そこで著者は第4級アンモニウム塩による分画方法の煩雑性,普遍性の欠如を解消するべく検討した。多くの文献を調査していた時,Medcalf and Larsen(1977)の文献が目に止まった。彼らはフコース含有多糖にマグネシウムの存在下で,各種濃度のエタノールを添加すると分画が可能となり,エタノール濃度が低い画分で得られたフコース含有多糖はウロン酸含有量が多いことを報告している。このことにヒントを得て,予備実験を行い,0.1%熱水抽出物水溶液に同量の0.1M塩化マグネシウムを加える。この溶液にエタノール濃度が20%になる様にエタノールを添加すると溶存しているアルギンがアルギン酸マグネシウムとなって析出,沈殿することを発見し,CP−硫酸多糖複合体より,極めて簡単なアルギンの分別沈殿法(西出・塚山1982)を創案したのである(図2)。この方法を用いて21種類の日本産褐藻類中のフコース含有多糖量を求めたのが表1である(西出ら1987)。
 次に,分別純化したフコース含有多糖の構成糖の研究に移ったのであるが,世界の研究レベルは高く,NMRを用いて行っていた。我々はGCしかない。なんとかGCを用いて糖組成の研究は出来ないものか検討した。フコース含有多糖にはMori and Nisizawa(1982)は6種類の中性糖の存在を,Larsen ・et al.(1970)は3種類のウロン酸の存在を報告している。GCを用いて糖を分析する場合糖が多くなると揮発性誘導体の調製いかんによってはクロマログラムが複雑となり重なり合うピークも多くなるので中性糖とウロン酸を分離することが良いと考えられた。そこで,多くの文献を調査したところ,Khym and Doherty(1952)は陰イオン交換樹脂(Dowexlx8)を用いて中性糖とウロン酸を分離定量しているので,この方法を修飾してフコース含有多糖中の中性糖とウロン酸を分離し,GCを用いて定量する方法を検討した。更に,GCによる分析操作も,同一カラムで中性糖とウロン酸の誘導体が分離できないか検討し,カラム液相に1.5%QF−1が最適であることを発見した。この結果,研究は飛躍的に進行し,この結果を第13回ISSで発表したのが表2である(Nishide ・et al.1990)。
 フコダインの精製,構成糖の研究結果を述べてきたが,塩化マグネシウム・エタノール沈殿法は水溶性アルギンの分離方法として完璧かというと欠点がある。それは熱水抽出法で抽出した粗フコイダンにしか適用出来ないことである。

3.ラミナラン
 褐藻中のラミナランは同化産物として知られ,古くから構造研究や生合成機作などの研究も行われている。
 高純度のラミナランの抽出は共存するフコイダンおよび水溶性アルギンをどのように除去するか,フコイダンの場合のラミナランおよび水溶性アルギンの除去と同じで,塩基性酢酸鉛法(西澤1939),イオン交換樹脂法(Black ・et al.1951),CPC法(Maeda and Nisizawa1968)などがある。
 前述の塩化マグネシウム・エタノール沈殿法で精製したフコイダンは水溶性アルギンは除去されているがラミナランの混在が考えられる。検討の結果,Schmidt(1962)が,DEAE・-・Sephadex A-・25を用いて中性多糖と酸性多糖を分離しているので,この方法を用いてラミナランとフコイダンの分別を検討した。
 先ず,Sigma社のフコイダンをDEAE-Sephadex A-25を用いて分別し回収率を求めたところ,回収率は77%で,フコイダンの一部が樹脂に吸着していることを知った。回収率が100%でないと分別が成功したとは言えないので樹脂に吸着・
・・21ア25・したフコイダンの回収方法を検討した。多くの文献を調査したところJu Minghou ・et al.(1985)が,寒天のDEAE-Sephadex A-25による分別を試み,寒天の一部が樹脂に吸着することを知り,尿素を用いて,樹脂に吸着した寒天を回収していることを知った。このことからDEAE-Sephadex A-25に吸着したフコイダンは適当な回収方法を用いれば回収されることがわかり,回収方法を検討した結果,樹脂を3M塩化ナトリウム溶液を用いて,100℃,3分間の加熱処理をすると吸着していたフコイダンが回収されることがわかり,フコイダンのすべてが回収されたことを認めた(表3)。
 次に,Sigma社にフコイダンとラミナランの混合物をDEAE-Sephadex A-25を用いて分別したところ,0.01M塩酸画分にラミナランが,3M塩化ナトリウム含有0.01M塩酸画分にフコイダンが溶出することを認めた(表4,図3)。塩化マグネシウム・エタノール沈殿法で水溶性アルギンを除いた5種類の褐藻の粗フコイダンを,この方法を用いて分別したところ,5種類中,3種類にラミナランが存在し,残る2種類にはラミナランが存在しないことがわかった(表5)。この結果DEAE-Sephadex A-25分別法はラミナランの存在の有無を判定する方法として用いることの出来る方法である事もわかった。このとき得られたラミナラン画分の硫酸加水分解物をグルコースを標品としてTLCを行ったところ,粗フコイダンより分別されたラミナランはラミナランであることが確認された(図4)(西出ら1994)。
 このようにして粗フコイダン中のラミナランの分別純化の方法を創出したのである。

4.アルギン
 アルギン酸は水に不溶性であると信じられてきた(Percival and McDowell1967)。しかし,フコイダンの抽出操作の過程でフコイダンの不純物の一つに水溶性アルギンの存在を知った(西出・塚山1982)。そこでフコイダン関係の文献を注意深く調べてみると古くから知られていたようであるが(Percival and Ross1950),それを回収して定量するということは行われていなかった。
 そこで,フコイダンの精製法の一つとして創設した塩化マグネシウム・エタノール法を用いて褐藻熱水抽出物中の水溶性アルギンの分画を行い得られた水溶性アルギンの電気泳動を行い水溶性アルギンはアルギン酸であることを確認した。ガゴメコンブの水溶性アルギンは分子量約50万で,マヌロン酸画分の多いアルギンであることが判明した(Nishide ・et al.1984)。
 この方法を用いて16種類の日本産褐藻中の水溶性アルギンとアルカリ可溶性アルギンの含有量およびM/G比を求めたのが表6である。この結果,褐藻中に含有されるアルギンは,イシゲ科海藻(2種類)では含有アルギンの35%が,ホンダワラ科海藻(8種類)では含有アルギンの9%が,コンブ科海藻(6種類)では含有アルギンの28%が水溶性アルギンであることがわかった(Nishide ・et al.1987)。
 次に,熱水法で硫酸多糖を抽出した残留海藻中のアルギンの性質を調べてみた。その結果,硫酸多糖の抽出時間が長くなると,@残留海藻中のアルギンの収量が減少すること,A含有アルギンの粘度が低下すること,B含有アルギンのM/G比が低下すること,即ち,グルロン酸量が増加することなどがわかった(西出ら1992)。硫酸多糖を熱水法で抽出する場合,硫酸多糖抽出後の海藻の利用が問題となる。含有アルギンの利用が出来なくなると海藻の価格が全部硫酸多糖にうわのせとなり硫酸多糖の価格が高くなる。そこで,硫酸多糖抽出後の海藻から市場性のあるアルギンの抽出が出来る様な硫酸多糖抽出方法の案出が課題となる。
 更に,褐藻を長時間加熱すると含有アルギンの含有量が低下し,M/G比も低下することが判明したので,この理由について検討した。表7・978E9に認められるように,100℃で,長時間加熱すると熱水可溶性アルギンが増加し海藻中に残留するアルギンが減少することがわかった。つぎに,熱水可溶性アルギンのM/G比をみると加熱時間が長くなるとM画分が増加しM/G比が高くなる。一方,海藻中に残留するアルギンのM/G比はM画分が減少しM/G比が低くなる。この結果,褐藻を長時間加熱すると,褐藻中のアルギン酸のM画分が熱により切れて溶出することがわかった(Nishide ・et al.1996)。
 最後に,日本のアルギン工業のおかれている現状について述べる。
 四面環海の日本では工業用に用いられる海藻資源は無尽蔵と考えられているがこれは誤りである。アルギン工業に用いられる褐藻資源は皆無といってもよいであろう。その理由は沿岸海域の褐藻の生育している場所,即ち,藻場は,水産業では沿岸海域の多種多様な有用魚介類が生活史のある期間,とくに幼生期,幼魚期,稚魚期,若令魚期に藻場を棲息場とし,海藻群落で生産される底生物,葉上生物を摂食して成長する,いわゆる保育場としての藻場を考えている。このため水産業では,藻場の保護,造成を積極的に行っている(日本水産学会 1981)。このような藻場を構成している褐藻を採集することは水産業関係者の理解が得られないのが実情である。そこで,海外の褐藻資源に目が向けられるのであるが,海外でも,資源保護の立場から海藻の採集は制約が多い。国によっては海岸に漂着した海藻のみ採集が認められているのが実情である。日本が南アフリカから輸入している海藻は図5にみられるように非常に硬いチップ状である。この形態は海藻の葉状部ではなく,茎部を乾燥,粉砕したもので,我々の見慣れているアラメ,カジメ,コンブ等の葉状部とは多いに異なっている。海藻の葉状部からのアルギンの抽出は容易であるが,茎部からの抽出は非常に困難を伴うことを我々は経験的に認識している。この困難を伴う茎部が100%抽出原料ともなると,その抽出方法はどのように行えばよいか検討の余地がある。即ち,研究対象となるのである。チップ状海藻を用いてアルギンの抽出を試みた結果を紹介する(西出・古川1980)。
 チップ状海藻を取り扱う場合二つの考え方がある。
 一つは,粉砕して細粒化する方法である。海藻茎は弾性があって粉砕しにくい。また,海藻の含水率によっては粉砕効率が低下するので,このような形態の海藻を粉砕するという操作は大変な作業で簡単ではない。粉砕機の保守管理も大変である。
 他の方法は膨潤軟化法である。この方法は葉状部からのアルギンの抽出工程で常時用いられている方法である。乾燥状態の葉状部を水に浸すと短時間で乾燥前の状態に戻る。この状態で炭酸ナトリウムを加えるとアルギンが浸出してくるのである。
 この二つの方法の内,膨潤軟化法はアルギン抽出工程で常用化しているので設備等を考慮してチップ状海藻からのアルギンの抽出は膨潤軟化法で行う事とした。
 チップ状海藻を水に浸けても葉状部とは異なり膨潤軟化は非常に困難である。そこで,思案の結果,木材のパルプ化にアルカリ蒸解法という古典的な方法(荒木1952)があるのでこの方法を修飾することとした。pHを10.00に設定し,浸出時間と温度を変化して実験を行ったのが図6である。この結果,100℃,3時間以上の処理で膨潤が平衡に達することがわかった。このような処理を行ったチップ状海藻からアルギンを抽出した結果が図7である。この結果,アルギン収量と抽出温度との関係は不規則である。この原因は試料の不均一性と考えられたので,試料の均一化をはかるために膨潤処理海藻をミキサーで摩砕後,アルギンを抽出した結果が図8である。図に認められるようにチップ状海藻よりアルギンを抽出する場合海藻の膨潤を充分に行い,なおかつ,試料の均一化を行うと抽出率は向上し,抽出温度とアルギン収量との間には極めて良好な相関関係が認められ,チップ状海藻からのアルギンの抽出実験は一応の目的を果たしたのである。
 この方法は南アフリカ産海藻を用いてのアルギン抽出方法であって,他国の海藻の場合に適応できるかは不明である。新しいアイデアのもとに新抽出法を検討する必要があるものと考えられる。・02
5.おわりに
 海藻多糖研究の経過を述べさせて頂いた。これといった独創的な研究もなく,落ち穂拾いに終始した感じがします。フコイダン,ラミナラン,アルギンの各項目で述べた問題点は,今後解決されなければならない問題であります。新しいアイデア,実験方法,実験機器を用いて再検討すると新しい研究課題および成果が生まれると思います。
 最後に,絶えずご指導,ご鞭撻を頂いた東京教育大学名誉教授,元日本大学教授 西澤一俊先生に感謝申し上げます。また日本大学生物資源科学部水産生物化学研究室において,内田直行教授,安斎寛助教授,塚山貴以子副手をはじめとする共同研究者,実験を共にした卒業生および在校生の方々に感謝致します。

文  献
阿武喜美子1972.第4級アンモニウム塩による分画.p.37-41.阿武喜美子・長谷川栄一(編)ムコ多糖実験法[T],南江堂,東京.
荒木綱男1952. 木材繊維.p.4-8.繊維素化学,産業図書,東京.
Black, W. A.P., Cornhill, W. J., Dewar, E. T. and Woodward, F. N. 1951. Manufacture of algal chemicals. V. Laboratory-scale isolation of laminarin from brown marine algae J. appl. Chem. 1:505-517.
富士川龍郎・中島克子1975.褐藻におけるフコイダン様多糖の分布.農化49:455-461.
Ji Minghou, Lahaye, M. and Yaphe, W. 1985. Structure of agar from ・Gracilaria app (Rhodophyta)・collected in the People's Republic of China. Bot. Mar. 28:521-528.
Khym, J. X. and Doherty, D. G. 1952. The analysis and separation of glucuronic and galacturonic acids by ion exchange. J. Am. Chem. Soc. 74:3199-3200.
Kloareg, B., Demarty, M. and Mabeau, S. 1986. Polyanionic characteristics of purified sulphated homofucans from brown algae. Inst. L. Biol. Macromol. 8:380-386.
Larsen, B., Haug, A. and Painter, T. 1970. Sulphated polysaccharides in brown algae. V・The native state of fucoidan in ・Ascophyllum nodosum and ・Fucus vesiculosus.Acta Chem. Scand. 24:3339-3352.
Maeda, M. and Nisizawa, K. 1968. Fine structure of laminaran of ・Eisenia bicyclis. J. Biochem. (Tokyo)・63:199-206.
Medcalf, D. G. and Larsen, B. 1977. Fucose-containing polysaccharides in the brown algae ・Ascophyllum nodosum and ・Fucus vesiculosus. Carbohydr. Res. 59:531-537.
Mori, H. and Nisizawa, K. 1982. Sugar constituents of sulfated polysaccharides from the fronds of ・Sargassum ringgoldianum. Nippon Suisan Gakkaishi. 48:981-986.
日本水産学会1981.藻場・海中林,水産学シリーズ[38],恒星社厚星閣,東京.
西川英一・古川正1980.南アフリカ産褐藻・Ecklonia maximaからのアルギン酸の抽出について−V,アルギン酸収量におよぼす前処理の影響.日本大学農獣医学部学術研究報告 37:289-294.
西山英一・塚山貴以子1982.ガゴメコンブのフコース含有多糖からの水溶性アルギンの除去.日水誌 48:1771-1773.
Nishide, E., Tsukayama, K., Uchida, N. and Nisizawa, K. 1984. Isolation of water-soluble alginate from brown algae. Hydrobiologia 116/117:557-562.
西出英一・安斎寛・内田直行1987.日本産褐藻類中のフコース含有多糖量について.日水誌 53:1083-1088.
Nishide, E., Anzai, H. and Uchida, N. 1987. A comparative investigation on the water-soluble and the alkali-soluble alginates from various Japanese brown algae. Nippon Suisan Gakkaishi. 53:1215-1219.
Nishide, E., Anzai, H., Uchida, N. and Nisizawa, K. 1990. Sugar constituents of fucose-containing polysaccharides from various Japanese brown algae. Hydrobiolgia 204/205:573-576.
西出英一・三島明子・安斎寛・内田直行1992. 熱水法で硫酸多糖を抽出した残留海藻中のアルギン酸の性質. 日本大学農獣医学部学術研究報告 49:140-142.
西出英一・吉原正美・加藤正・箱根保・鎌田裕・安斎寛・内田直行1994. DEAE-セファデックスカラムクロマトグラフィーによるラミナランとフコイダンの分別. 日本大学農獣医学部学術研究報告 51:103-107.
Nishide, E., Anzai,H., Uchida, N. and Nisizawa, K. 1996. Changes in M: G ratios of extracted and residual alginate fractions on boiling with water the dried brown alga ・Kjellmaniella crassifolia (Laminariales, Phaeophyta). Hydrobiologia 326/327:515-518.
西澤一俊1939. Laminarin・の研究 (第一報) アラメ (・Eisenia bicyclis) よりの単離並に其の化学的性質に就いて.日化誌 60:1020-1024.
Percival, E. G. V. and Ross, A. G. 1950. Fucoidin. Part T. The isolation and purificatio of fucoidin from brown seaweed. J. Chem. Soc. 717-720.
Percival, E. and McDowell, R. H. 1967. Algin. p. 99-126. In Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides. Academic press. London.
Schmids, M. 1962. Fractionation of acid mucopolysaccharides on DEAE-Sephadex anion exchanger. Biochim. Biophys. Acta. 63:346-348.